Knockout of invertase inhibitor gene by CRISPR/CAS9 method in potato
Küçük Resim Yok
Tarih
2021
Yazarlar
Dergi Başlığı
Dergi ISSN
Cilt Başlığı
Yayıncı
Niğde Ömer Halisdemir Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü
Erişim Hakkı
info:eu-repo/semantics/openAccess
Özet
Patateste zarar yapan ve verimi düşüren çeşitli hastalık etmenleri her yıl büyük ölçüde ekonomik kayıplara neden olmaktadır. Apoplastik (hücre duvarı) invertaz enzimi, patojen enfeksiyonu durumunda apoplastik invertaz inhibitörü tarafından post-translasyonel olarak düzenlenen bitki savunma mekanizmasında potansiyel bir rol oynayabilir. Bu çalışmada, patateste apoplastik invertaz inhibitör genini hedeflemek için CRISPR/Cas9 teknolojisi kullanılmıştır. Diploid Solanum chacoense türüne ait M6 genotipi ve tetraploid Solanum tuberosum türüne ait Desiree çeşidinin halihazırda mevcut DNA dizi bilgileri kullanılarak bu geni hedefleyen iki tek kılavuzlu RNA (sgRNA) tasarlanmıştır. Eşzamanlı olarak, bir intron dizisi ile kesilen gusA geni içeren pBIN19 ekspresyon vektörünü barındıran GV2260 suşu kullanılarak, dönüşüme dirençli S. chacoense M6 genotipi için Agrobacterium aracılı bir dönüştürme protokolü geliştirilmiştir. Bu protokol kullanılarak hem transkript hem de protein seviyelerinde gusA genini ifade eden transgenik S. chacoense M6 bitkilerinin rejenerasyonu sağlanmıştır. Etkisileştirme denemelerinde, kallus için Sanger dizi bilgisi kullanılarak indeller gözlenmiş ve rejenere olan aday bitkilerin azaltılmış gen ekspresyon seviyesi sergilediği RT-qPCR ile gösterilmiştir. Apoplastik invertaz inhibitör geninin patateste stres tepkisi ve savunma mekanizmalarındaki rolünü anlamak için yeni çalışmalara ihtiyaç vardır.Patateste zarar yapan ve verimi düşüren çeşitli hastalık etmenleri her yıl büyük ölçüde ekonomik kayıplara neden olmaktadır. Apoplastik (hücre duvarı) invertaz enzimi, patojen enfeksiyonu durumunda apoplastik invertaz inhibitörü tarafından post-translasyonel olarak düzenlenen bitki savunma mekanizmasında potansiyel bir rol oynayabilir. Bu çalışmada, patateste apoplastik invertaz inhibitör genini hedeflemek için CRISPR/Cas9 teknolojisi kullanılmıştır. Diploid Solanum chacoense türüne ait M6 genotipi ve tetraploid Solanum tuberosum türüne ait Desiree çeşidinin halihazırda mevcut DNA dizi bilgileri kullanılarak bu geni hedefleyen iki tek kılavuzlu RNA (sgRNA) tasarlanmıştır. Eşzamanlı olarak, bir intron dizisi ile kesilen gusA geni içeren pBIN19 ekspresyon vektörünü barındıran GV2260 suşu kullanılarak, dönüşüme dirençli S. chacoense M6 genotipi için Agrobacterium aracılı bir dönüştürme protokolü geliştirilmiştir. Bu protokol kullanılarak hem transkript hem de protein seviyelerinde gusA genini ifade eden transgenik S. chacoense M6 bitkilerinin rejenerasyonu sağlanmıştır. Etkisileştirme denemelerinde, kallus için Sanger dizi bilgisi kullanılarak indeller gözlenmiş ve rejenere olan aday bitkilerin azaltılmış gen ekspresyon seviyesi sergilediği RT-qPCR ile gösterilmiştir. Apoplastik invertaz inhibitör geninin patateste stres tepkisi ve savunma mekanizmalarındaki rolünü anlamak için yeni çalışmalara ihtiyaç vardır.
Several pathogens infect and afflict potato yield causing colossal economic losses annually. Apoplastic (cell wall) invertase enzyme could play a potential role in plant defense mechanism upon the pathogen infection, which is regulated post-translationally by apoplastic invertase inhibitor. The present study utilized CRISPR/Cas9 technology to target apoplastic invertase inhibitor gene in potato. Two single-guided RNAs (sgRNAs) targeting this gene were designed from the already available DNA sequence information of diploid Solanum chacoense M6 and tetraploid Solanum tuberosum cv. Desiree. Simultaneously, an Agrobacterium-mediated transformation protocol for recalcitrant S. chacoense M6 potato was developed using GV2260 strain harboring pBIN19 expression vector containing gusA gene interrupted by an intronic sequence. We demonstrated the regeneration of S. chacoense M6 transgenic plants expressing gusA gene both at transcript and protein levels. In knockout experiments, indels were observed using Sanger sequencing data for calli, and the candidate regenerated plants exhibited reduced gene expression level as demonstrated by RT-qPCR. Further studies are needed to understand the role of apoplastic invertase inhibitor gene in stress response and defense mechanisms in potato.
Several pathogens infect and afflict potato yield causing colossal economic losses annually. Apoplastic (cell wall) invertase enzyme could play a potential role in plant defense mechanism upon the pathogen infection, which is regulated post-translationally by apoplastic invertase inhibitor. The present study utilized CRISPR/Cas9 technology to target apoplastic invertase inhibitor gene in potato. Two single-guided RNAs (sgRNAs) targeting this gene were designed from the already available DNA sequence information of diploid Solanum chacoense M6 and tetraploid Solanum tuberosum cv. Desiree. Simultaneously, an Agrobacterium-mediated transformation protocol for recalcitrant S. chacoense M6 potato was developed using GV2260 strain harboring pBIN19 expression vector containing gusA gene interrupted by an intronic sequence. We demonstrated the regeneration of S. chacoense M6 transgenic plants expressing gusA gene both at transcript and protein levels. In knockout experiments, indels were observed using Sanger sequencing data for calli, and the candidate regenerated plants exhibited reduced gene expression level as demonstrated by RT-qPCR. Further studies are needed to understand the role of apoplastic invertase inhibitor gene in stress response and defense mechanisms in potato.
Açıklama
Anahtar Kelimeler
Potato, Apoplastic invertase inhibitor, M6, Desiree, CRISPR/Cas9, Patates, Apoplastik invertaz inhibitörü, M6, Desiree, CRISPR/Cas9
Kaynak
WoS Q Değeri
Scopus Q Değeri
Cilt
Sayı
Künye
Dangol, S.D. (2021). Knockout of invertase inhibitor gene by CRISPRCAS9 method in potato. (Doktora Tezi) Niğde Ömer Halisdemir Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Niğde
