A plant-mediated RNAi strategy targeting ache1 and SEC23 genes to combat tomato leafminer (tuta absoluta (meyrick)) in tomato

Basit Öğe Kaydı
dc.contributor.advisorDemirel, Ufuk
dc.contributor.advisorBakhsh, Allah
dc.contributor.authorHashmı, Muneeb Hassan
dc.date.accessioned2024-11-04T20:08:55Z
dc.date.available2024-11-04T20:08:55Z
dc.date.issued2022
dc.departmentNiğde ÖHÜ, Fen Bilimleri Enstitüsü, Tarımsal Genetik Mühendisliği Ana Bilim Dalı
dc.descriptionFen Bilimleri Enstitüsü, Tarımsal Genetik Mühendisliği Ana Bilim Dalı
dc.description.abstractGüney Amerika'ya özgü domates güvesi olarak da bilinen Tuta absoluta, dünyanın en önemli domates zararlılarından biridir. Güvelerin, böcek ilaçlarına karşı geliştirdiği direnç ve tarımsal kimyasalların risklerine ilişkin artan endişeler, yeni zararlı mücadele stratejilerinin geliştirilmesine olan ihtiyacı artırmıştır. Bu stratejilerden birisi, çift zincirli RNA (dsRNA) vasıtasıyla tetiklenen RNA müdahale (RNA interferans) yöntemidir. Bu çalışma, T. absoluta'nın iki önemli genini, kılıf proteini kompleksi 2, COPII (SEC23) ve Asetilkolinesteraz 1'i (AChE1) hedefleyen bitki aracılı RNAi'nin (PMRI) bu böcekle mücadeledeki potansiyelini ortaya koymuştur. İstenilen gen kısımlarını klonlamak için pFGC5941 RNAi ekspresyon vektörü ve AChE1 ve SEC23 genlerinin kısmi cDNA'sını çoğaltmak için antisens ve sens primerleri kullanılmıştır. Rio Grande domates çeşidinin üç farklı eksplantını (hipokotiller, kotiledon nodları ve yapraklar) enfekte etmek için, 3 farklı plazmidi (pFGC5941_hpSEC23, pFGC5941_hpAChE1, pBIN19-uidA) içeren Agrobacterium tumefaciens EHA105 suşu kullanılmıştır. T-DNA'nın bitki genomuna entegrasyonu, standart PCR teknikleri kullanılarak doğrulanmıştır. Transgenik hatların qPCR analizinde, kontrole kıyasla en yüksek %55 nispi ifade artışı gözlemlenmiştir. RNAi etkinliğini değerlendirmek için Tuta absoluta'nın farklı evrelerdeki (2., 3., 4. evre) larvaları, transgenik Rio Grande bitkileriyle beslendi. Transgenik bitkilerle beslenen böceğin AChE1 ve SEC23 ifade seviyeleri, transgenik olmayan ve vektör kontrol bitkileri ile beslenmesi durumuyla karşılaştırıldığında, nispi ifade seviyeleri sırasıyla %54 ve %53 oranında azalmıştır. AChE1-dsRNA ile beslenen 2. ve 3. evre larvalarda, beslenmeden 96 saat sonra maksimum ölüm (% 11 - 15) gözlemlenirken , kontrol grubunda ölüm gözlemlenmemiştir. Benzer şekilde SEC23 dsRNA, kontrol ile karşılaştırıldığında 2. ve 3. evre larvalarında %10-20 oranında ölüme neden olmuştur. Yaprak biyoanalizleri yapıldıktan sonra, Tuta absoluta için PMRI kullanılarak %15-60 larva ölüm oranı ve %40-60 knock-down etkisi gözlenmiştir. dsRNA'larla beslenen pupaların %60-80'i ergine dönüşmezken kontrol grubunda bulunan pupalar, sağlıklı ve en yüksek yüzdeyle erginlere dönüşmüştür. dsRNA ile beslenen larvaların ağırlık değişiminin daha az olduğu gözlemlenmiştir. RNAi ve Hypnose total (500g/L Primiphos Metil+ 7.5 g/L Emamektin Benzoat) birlikte kullanılarak bir deneme yapılmıştır. Bu denemede, dsAChE1 ifade eden yapraklarla beslenen larvalara %80 doz insektisit uygulaması yapılmış ve sonuç olarak, larvalarda %100 ölüm gözlemlenmiştir. Bu sonuçlar, bitki aracılı RNAi hedefleme yönteminde dsAChE1 ve dsSEC23'ün, hedefleri olan böcek genleri SEC23 ve AChE1'e karşı etkili olduğunu ve transgenik bitkilerle beslenen T. absoluta larvalarının genel büyümesi ve gelişimi üzerinde susturucu bir etki olduğunu göstermiştir. Sonuçta, dsSEC23 ve dsAChE1'in, T. absoluta'nın domates üzerindeki zararlı etkilerini azaltmak için potansiyel hedefler olduğu kanıtlanmıştır. Bu çalışma, dünyada domates üretiminde önemli kayıplara neden olan domates böcek zararlıları ile mücadelede alternatif, etkili ve güvenilir bir yöntemin entegrasyonuna iyi bir örnektir.
dc.description.abstractTuta absoluta, also known as tomato pinworm native to South America, is one of the world's most devastating tomato pests. The apparent resistance of moths to insecticides and rising concern about the risks of agrochemicals have raised the need for the development of innovative pest management strategies. One of the strategies is RNA interference, triggered by dsRNA. This study exhibited the potential of plant-mediated RNAi (PMRI) that targets two important genes of T. absoluta, coat protein complex 2, COPII (SEC23) and Acetylcholinesterase 1 (AChE1) in combat against this insect. The pFGC5941 RNAi expression vector was used to clone desired fragments, and antisense and sense primers were used to amplify the partial cDNA of AChE1 and SEC23 genes. Agrobacterium tumefaciens strain EHA105 harboring 3 different plasmids (pFGC5941_hpSEC23, pFGC5941_hpAChE1, pBIN19-uidA) was used to infect three different explants (hypocotyls, cotyledonary nodes, and leaves) of the Rio Grande tomato cultivar. Proper integration of T-DNA into the plant genome in primary transformants was confirmed using standard PCR techniques. qPCR analysis of transgenic lines showed 55% highest relative expression as compared to the non-transgenics. Three different instars (2nd, 3rd, 4th) larvae of Tuta absoluta were fed on transgenic Rio Grande plants to assess RNAi efficiency. Relative expression levels AChE1 and SEC23 in the insect reduced by 54% and 53%, respectively, when fed on transgenic plants compared to the non-transgenic and vector control plants. After 96 hours of feeding, AChE1-dsRNA-fed larvae showed maximum mortality (11 - 15 %) at the 2nd and 3rd instar larval stages while no mortality was observed in the control group. Similarly, SEC23 dsRNA caused 10-20 % mortality of 2nd and 3rd instar larvae as compared to the control. After conducting leaf bioassays, larval mortality of 15-60%, and 40 to 60% knockdown efficiency was observed using PMRI for Tuta absoluta. 60-80 % of pupae were not converted to adults among individuals who ingested dsRNAs while control group adults emerged healthy and with the highest percentage. Treated larvae showed lower fold change in larval weight. Synergism of RNAi with Hypnose total (500g/L Primiphos Methyl+ 7.5 g/L Emamectin Benzoate) showed 100% mortality of larvae when fed on dsAChE1 expressing leaves with 80% dosage application of the insecticide. These results indicate the functionality of dsAChE1, and dsSEC23 through plant-mediated RNAi against their insect gene targets SEC23 and AChE1 and have shown a silencing effect on the overall growth and development of treated T. absoluta larvae. dsSEC23 and dsAChE1 were proved to be potential targets to reduce the damaging effects of T. absoluta on tomato crops. This study is a good example of the integration of an alternative, effective and reliable method to cope with tomato insect pests that cause significant losses in tomato production in the world.
dc.identifier.endpage193
dc.identifier.startpage1
dc.identifier.urihttps://tez.yok.gov.tr/UlusalTezMerkezi/TezGoster?key=r4I1HnmXxFQovUpyAyUmxB6TmI5Rd1ng7-gW9z5j9EpX6eMyJ8lhHzerJGS2sNoS
dc.identifier.urihttps://hdl.handle.net/11480/9768
dc.identifier.yoktezid789653
dc.language.isoen
dc.publisherNiğde Ömer Halisdemir Üniversitesi
dc.relation.publicationcategoryTez
dc.rightsinfo:eu-repo/semantics/openAccess
dc.snmzKA_2024
dc.subjectBiyoteknoloji
dc.subjectBiotechnology
dc.titleA plant-mediated RNAi strategy targeting ache1 and SEC23 genes to combat tomato leafminer (tuta absoluta (meyrick)) in tomato
dc.title.alternativeDomateste, domates güvesiyle (tuta absoluta (meyrıck)) mücadelede ache1 ve SEC23 genlerini hedef alan bitki aracılı rnai stratejisi
dc.typeDoctoral Thesis

Dosyalar

Koleksiyon

Fen Bilimleri Enstitüsü Tez Koleksiyonu